Genetica · Diagnostica molecolare
Pannelli NGS neonatali
Guida clinica alla selezione e interpretazione dei pannelli di sequenziamento di nuova generazione (NGS) in terapia intensiva neonatale: pannelli mirati, esoma clinico e WGS rapido.
ACMG/AMP 2015
ClinGen
ACGS 2020
sezioni
Strumento orientativo. L'interpretazione delle varianti genetiche deve essere effettuata da un medico genetista. La classificazione ACMG/AMP riportata è semplificata a scopo didattico.
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Che cos'è l'NGS
Definizione
Il NGS (Next-Generation Sequencing) — o sequenziamento massivo parallelo — analizza simultaneamente milioni di frammenti di DNA, permettendo di leggere la sequenza nucleotidica di centinaia o migliaia di geni in un singolo esperimento. A differenza dell'array-CGH che rileva solo variazioni del numero di copie (CNV), l'NGS identifica varianti di sequenza: sostituzioni singole (SNV), piccole inserzioni/delezioni (indel) e, in configurazioni avanzate, varianti strutturali.
Livelli di analisi NGS
| Approccio | Copertura | Geni | TAT tipico | Costo indicativo |
|---|---|---|---|---|
| Pannello mirato | Gruppo selezionato di geni | 10–500 | 2–4 settimane | €500–1.500 |
| Esoma clinico (CES) | Tutti gli esoni codificanti | ~20.000 | 4–8 settimane | €1.500–3.000 |
| Esoma completo (WES) | Esoni + regioni UTR | ~22.000 | 4–12 settimane | €2.000–4.000 |
| Genoma (WGS) | Intero genoma (inclusi introni) | Tutti | 2–6 settimane (rapido: <2 sett.) | €3.000–6.000 |
Perché l'NGS in TIN
Nei neonati critici con sospetta malattia genetica, la diagnosi precoce modifica il management nel 25–40% dei casi (Petrikin 2015, Willig 2015). Il WGS rapido (<14 giorni) ha dimostrato un impatto clinico nel 21% dei neonati arruolati nello studio NICUSeq (Krantz 2021). Il trio (paziente + entrambi i genitori) aumenta la detection rate e riduce i VUS.
Concetti chiave
- Pannello mirato → alta copertura su pochi geni, rapido, economico
- WES/WGS → analisi agnostica, più completa ma più VUS
- Trio (proband + genitori) → +15–20% detection rate rispetto a singolo
- NGS non rileva: espansioni trinucleotidiche, metilazione, mosaicismo <15–20%
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Indicazioni al test NGS in neonatologia
Indicazioni prioritarie (AAP/ACMG)
- Anomalie congenite multiple con array-CGH normale
- Epilessia neonatale farmacoresistente (esordio <28 giorni)
- Cardiomiopatia/cardiopatia non spiegata dalla cardiologia strutturale
- Ipotonia severa con CK normali e array-CGH normale
- Acidosi metabolica inspiegata / iperammoniemia / ipoglicemia persistente
- Displasia scheletrica (segni radiologici suggestivi)
- Dismorfismi facciali con ritardo di crescita e array negativo
- Insufficienza midollare / citopenia a esordio neonatale
- Immunodeficienza congenita severa (SCID, HLH)
- Colestasi neonatale non spiegata da cause chirurgiche/infettive
Quando scegliere il pannello mirato vs WES/WGS
| Scenario | Approccio consigliato | Razionale |
|---|---|---|
| Fenotipo suggestivo di una patologia nota | Pannello mirato | Rapido, copertura alta (>99.5%), meno VUS |
| Fenotipo complesso senza diagnosi specifica | WES trio | Analisi agnostica, detection rate 25–40% |
| Neonato critico, necessità urgente | rWGS (rapido) | Risultato in 3–7 giorni, impatto su management |
| Sospetto CNV + variante di sequenza | WGS | Rileva sia SNV/indel che CNV/SV in un singolo test |
| Pannello negativo ma sospetto persiste | Escalation a WES/WGS | Geni nuovi non inclusi nel pannello originale |
Raccomandazione ACMG 2023: Nei neonati con malattia acuta e sospetta eziologia genetica, il rWGS (rapid Whole-Genome Sequencing) dovrebbe essere considerato come test di primo livello quando disponibile, con risultati attesi in <7 giorni.
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Database pannelli neonatali
I pannelli più comunemente richiesti in TIN, con geni principali, indicazioni e turnaround time. Cerca per nome, gene o indicazione clinica.
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Classificazione delle varianti (ACMG/AMP)
Le 5 classi ACMG/AMP 2015
Le linee guida ACMG/AMP (Richards et al. 2015) classificano le varianti di sequenza in 5 categorie, utilizzando 28 criteri di evidenza suddivisi in pathogenic (PVS, PS, PM, PP) e benign (BA, BS, BP).
| Classe | Significato | Azione clinica |
|---|---|---|
| 5 — Patogenica | Evidenza forte di causalità | Diagnosi confermata, counseling, test familiari |
| 4 — Probabilmente patogenica | Evidenza sufficiente (>90%) | Diagnosi confermata, counseling, test familiari |
| 3 — VUS | Significato incerto | NON usare per diagnosi. Segregazione familiare, follow-up, rianalisi a 12–24 mesi |
| 2 — Probabilmente benigna | Evidenza sufficiente per benigna | Non rilevante clinicamente |
| 1 — Benigna | Polimorfismo comune (>5% in gnomAD) | Non rilevante clinicamente |
VUS ≠ diagnosi. Le varianti di significato incerto (classe 3) non devono essere utilizzate per formulare una diagnosi né per modificare il management clinico. La percentuale di VUS nei pannelli ampi/WES può raggiungere il 30–50% dei risultati.
Criteri principali di patogenicità
- PVS1 — Variante null (frameshift, nonsense, splicing ±1/2) in gene con meccanismo loss-of-function noto
- PS1 — Stesso cambio aminoacidico di una variante patogenica nota
- PS2 — Variante de novo (confermata) in paziente con fenotipo compatibile
- PM2 — Assente o estremamente rara in gnomAD (<0.001%)
- PP3 — Predizioni bioinformatiche concordanti (REVEL >0.7, CADD >25)
Risorse per l'interpretazione
- ClinVar (NCBI) — database pubblico di varianti classificate
- gnomAD — frequenze alleliche nella popolazione generale
- ClinGen — curated gene-disease validity e dosage sensitivity
- OMIM — catalogo delle malattie mendeliane
- HGMD — database di mutazioni note (accesso istituzionale)
- VarSome — classificazione ACMG automatica
Gestione dei VUS
- Segregazione familiare: testare i genitori. VUS de novo → upgrade probabile. VUS ereditata da genitore sano → downgrade probabile.
- Correlazione fenotipica: il fenotipo del paziente corrisponde al gene? Consultare OMIM e letteratura.
- Rianalisi periodica: richiedere rianalisi dei dati grezzi a 12–24 mesi. Fino al 10–15% dei VUS viene riclassificato.
- Studi funzionali: in casi selezionati, saggi in vitro o modelli animali possono risolvere VUS critici.
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Algoritmo decisionale
L'algoritmo seguente guida la scelta del test NGS appropriato in base al quadro clinico e all'urgenza diagnostica.
Selezione test NGS — Algoritmo decisionale
Note sull'algoritmo
- rWGS trio: disponibile in centri selezionati (Italia: Bambino Gesù, Meyer, Burlo Garofolo). Tempo referto 3–7 giorni. Indicato in neonati critici dove la diagnosi modifica il management (es. inizio terapia, sospensione cure intensive).
- Pannello negativo ≠ esclusione: un pannello copre solo i geni noti al momento della progettazione. Nuovi geni-malattia vengono scoperti ogni anno.
- Rianalisi: i dati grezzi di WES/WGS possono essere rianalizzati con pipeline aggiornate. Circa 10–15% dei casi non diagnosticati trovano una diagnosi alla rianalisi.
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Limiti e insidie dell'NGS
Cosa l'NGS NON rileva
| Tipo di variante | Limitazione | Test alternativo |
|---|---|---|
| Espansioni trinucleotidiche | Non rilevabili con NGS standard (short-read) | PCR specifica (es. DMPK per DM1, FMR1 per X-fragile) |
| Difetti di metilazione | NGS non analizza lo stato epigenetico | MS-MLPA (Prader-Willi, Angelman, BWS, SRS) |
| Varianti in regioni ripetitive | Short-read NGS non mappa pseudogeni/duplicazioni segmentali | Long-read sequencing, MLPA (es. SMN1/SMN2) |
| Mosaicismo basso | Sensibilità limitata sotto il 15–20% | Deep sequencing mirato, ddPCR |
| Varianti introniche profonde | WES copre solo esoni; pannelli possono includere regioni selezionate | WGS, RNA-seq |
| Varianti strutturali grandi | CNV >esone singolo: WES ha sensibilità ridotta | Array-CGH, WGS, MLPA |
Errore comune: Un risultato NGS “negativo” NON esclude una malattia genetica. Il pannello copre solo i geni inclusi, e il WES ha una copertura del 95–98% dell'esoma. Sempre correlare con clinica e considerare test complementari.
Insidie nella refertazione
- VUS multipli: in WES si trovano 2–5 VUS. Non tutti sono rilevanti. Correlare ogni VUS con il fenotipo.
- Varianti in geni con penetranza incompleta: una variante patogenica in un gene a penetranza variabile (es. LMNA) può non manifestarsi nel periodo neonatale.
- Secondari (incidental findings): le linee guida ACMG v3.2 raccomandano di riportare varianti patogeniche in 81 geni “actionable” (es. BRCA1/2, KCNQ1). I genitori devono dare consenso informato pre-test.
- Coverage gaps: esoni con bassa copertura (<20x) possono nascondere varianti. Verificare sempre il report di qualità.
- Falsi positivi in regioni omologhe: pseudogeni (es. PMS2/PMS2CL, STRC/STRCP1) possono generare chiamate errate.
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Riferimenti bibliografici
- Richards S et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of ACMG and AMP. Genet Med 2015;17:405–424.
- Petrikin JE et al. Rapid whole genome sequencing and precision neonatology. Semin Perinatol 2015;39:623–631.
- Willig LK et al. Whole-genome sequencing for identification of Mendelian disorders in critically ill infants. Genet Med 2015;17:774–781.
- Krantz ID et al. Effect of whole-genome sequencing on the clinical management of acutely ill infants with suspected genetic disease (NICUSeq). JAMA Pediatrics 2021.
- Clark MM et al. Meta-analysis of the diagnostic and clinical utility of genome and exome sequencing and chromosomal microarray in children with suspected genetic diseases. NPJ Genom Med 2018;3:16.
- Manickam K et al. Exome and genome sequencing for pediatric patients with congenital anomalies or intellectual disability: an evidence-based clinical guideline of the ACMG. Genet Med 2021;23:2029–2037.
- Stark Z et al. Does genomic sequencing early in the diagnostic trajectory make a difference? A follow-up study of clinical outcomes and cost-effectiveness. Genet Med 2019;21:173–180.
- Ellard S et al. ACGS Best Practice Guidelines for Variant Classification in Rare Disease 2020. Association for Clinical Genomic Science.
- Miller DT et al. ACMG SF v3.2 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing. Genet Med 2023;25:100866.